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原子力顯微鏡及其在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用

張平城 成英俊 方曄 王中懷 白春禮

（中國科學(xué)院化學(xué)研究所STM室 ?北京 ?100080)

摘要 ?

本文描述了原子力顯微鏡的基本原理，并對其在成像細(xì)胞、細(xì)胞器、染色體、細(xì)胞膜方面的應(yīng)用進(jìn)行了評述，最后還給出了發(fā)生在細(xì)胞中的動態(tài)過程的兩個有趣的例子。

關(guān)健詞

原子力顯微鏡，細(xì)胞，結(jié)構(gòu)，成像，動態(tài)學(xué)

在細(xì)胞生物學(xué)發(fā)展的歷史過程中，顯微鏡長期以來是其重要的研究工具。掃描隧道顯微鏡的研制成功是顯微學(xué)上的一場革命，它導(dǎo)致了一系列掃描探針顯微鏡[原子力顯微鏡（AFM）、激光力顯微鏡（LAFM）、磁力顯微鏡（MFM）、彈道電子發(fā)射顯微鏡（BEEM）、光子掃描隧道顯微鏡（PSTM）]的誕生（白春禮等，1992）。這些儀器通過一個探針接近被測物體的表面，從而取得其表面在空間分辨上的某些特性信息。如隧道電流（tunneling current）、相互作用力、離子電導(dǎo)性（ion conductance）、磁場分布等。在這一系列用于生物學(xué)研究的儀器中，最有前途的應(yīng)首推原子力顯微鏡（Binnig等，1986；Rugar等，1990）。

對于剛性的樣品，原子力顯微鏡通?？梢赃_(dá)到原子級分辨率，但對于柔軟的生物材料，目前可達(dá)到的橫向分辨率為1-50 nm，這種儀器有可能在生理緩沖液中對樣品成像，并取得其動態(tài)數(shù)據(jù)，因此它在生物學(xué)研究中具有誘人的應(yīng)用前景。除了成像之外，原子力顯微鏡還有可能實現(xiàn)對生物膜及生物大分子進(jìn)行操作，并測定各種局域的物理和生物物理性質(zhì)，可見原子力顯微鏡對細(xì)胞生物學(xué)研究的未來發(fā)展將有重要影響，下面簡述這種新型儀器的簡單原理及重要應(yīng)用。

原子力顯微鏡的基本工作原理

AFM系統(tǒng)主要由以下幾部分組成：（1）帶針尖的力敏感元件；（2）力敏感元件運動檢測裝置；（3）監(jiān)控力敏感元件運動的反饋回路；（4）掃描系統(tǒng)（一般使用壓電陶瓷），其作用是使樣品進(jìn)行掃描運動；（5）圖象采集及顯示；（6）圖象處理系統(tǒng)。其中關(guān)鍵的是前兩部分。

AFM的工作原理示意圖

圖1. AFM的工作原理示意圖

Fig.1 Schematic diagram of AFM working principle

AFM的工作原理如圖1所示（Binnig等，1986）。將一個對微弱力極敏感的微懸臂一端固定，另一端有一微小的針尖，針尖與樣品表面輕輕接觸。使針尖在樣品的表面上掃描，由于針尖尖端原子與樣品表面原子間存在極微弱的排斥力（10-8—10-6N），如果控制這種力在掃描過程中保持恒定，則微懸臂將在垂直于樣品表面的方向上起伏運動，利用隧道電流檢測法或光學(xué)檢測方法，測定微懸臂對應(yīng)于掃描各點的位置變化，從而可以獲得樣品表面形貌的信息。

根據(jù)AFM 所測力的性質(zhì)的不同，其工作模式及微懸臂運動的檢測方法將有所不同。所謂工作模式，主要是指AFM工作時微懸臂運動所處的狀態(tài)，主要可分為兩種。一種為準(zhǔn)靜態(tài)工作模式，此時針尖與樣品的相互作用力較強(qiáng)，微懸臂有較大形變，可用隧道電流法，電容及激光束偏轉(zhuǎn)探測法等直接檢測此形變。處于該模式，針尖與樣品的間距小于0.03nm，基本上是緊密接觸的（故又稱接觸模式）。由于此時二者電子云發(fā)生重疊，導(dǎo)致儀器的分辨率極高，可達(dá)原子級水平。運用此種模式可測量原子間的相互作用力，所測最小力可達(dá)10-9N。對于針尖與樣品間的摩擦力，也可用該模式進(jìn)行測量，這時最小檢測極限可達(dá)10-10N。根據(jù)反饋方式的不同，該模式又可分成恒力模式和形變變化模式兩種。前者反饋信號控制樣品上下運動，使得微懸臂的形變及其與樣品間的相互作用力保持恒定；后者樣品只進(jìn)行掃描運動，反饋線路控制使得微懸臂隨表面的起伏而上下運動。此時，由于反饋直接控制隧道針尖，導(dǎo)致儀器工作穩(wěn)定，但其數(shù)據(jù)的解釋要困難一些。

上面描述的這種接觸模式適應(yīng)于對硬表面的觀察，并可達(dá)到較高的分辨率，但這種接觸模式與樣品表面相互作用較強(qiáng)，對于生物樣品，由于它相對于云母，石墨及金等固體材料具有較大的柔軟性，目前對其觀察還沒有達(dá)到足夠高的分辨率，在針尖掃描時，有時還會造成樣品表面的損傷。而對于吸附在堅硬表面的樣品（通常為生物大分子），在探針的作用下有時會被移動而不利于成像。對于生物材料，由于其表面較軟如果采用接觸模式，在不降低其分辨率的情況下，應(yīng)盡量降低針尖與樣品的作用力，以免造成表面損傷。

AFM的另一種工作摸式是動態(tài)工作模式。此時微懸臂或樣品進(jìn)行高頻振動（一般由壓電陶瓷器件產(chǎn)生）。對于微懸臂振動情況，高頻振動頻率fres接近其固有振動頻率。針尖與樣品的相互作用力對其間距的變化率F’將影響微懸臂振動頻率fref。對于振動較弱的情況，△f = F'fref／2k，其中，k為微懸臂的力常數(shù)，F(xiàn)’為針尖與樣品的相互作用力對其間距的變化率，振動頻率的變化將導(dǎo)致振動幅度出現(xiàn)可測量的變化。因此，測量這個變化可知道F'，通過積分就可獲得相互作用力的大小。測量振動幅度的變化一般可用內(nèi)差法或外差法等光學(xué)干涉法進(jìn)行，此時微懸臂振動幅度一般為納米量級，這就要求針尖與樣品間的平均間距必須較大，互相不接觸，故該模式又可稱為非接觸模式。這種模式適合于對細(xì)胞類等柔性生物樣品的觀察，由于針尖距樣品較遠(yuǎn)，與樣品表面的相互作用較小，因此對樣品造成破壞或發(fā)生移動的可能性較小。但同時由于針尖距樣品較遠(yuǎn)的原因，導(dǎo)致以此模式工作的AFM圖象橫向分辨率降低，達(dá)不到原子級水平，一般為納米級水平。

幾種細(xì)胞的AFM圖象

圖2 ?幾種細(xì)胞的AFM圖

Fig.2 ?AFM image of some cells

A：干燥的心肌細(xì)胞質(zhì)膜所呈現(xiàn)的典型的絲狀排列結(jié)構(gòu)（23μm×23μm）；
B：生理緩沖液中活的膠質(zhì)細(xì)胞的AFM圖象（65μm×65μm)；
C：空氣中干燥的肌細(xì)胞核的AFM圖象；
D：來自CHL細(xì)胞染色體所呈現(xiàn)的四臂結(jié)構(gòu)及亞結(jié)構(gòu)（10μm×10μm）。

最近本實驗室已成功地研制一臺激光檢測原子力顯微鏡，并已達(dá)到原子級分辨率。關(guān)于這臺顯微鏡的詳細(xì)描述可參見吳浚翰等（1993）的報道。用這臺儀器已成功地對煙草花葉病毒（張平城等，1993），波菜葉綠體（Cheng et al.,1993）的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了成像。

用原子力顯微鏡對細(xì)胞進(jìn)行成像

1．細(xì)胞及細(xì)胞器的成像 ?

各種固定并干燥的細(xì)胞可用AFM來成像。1990年Gould等用原子力顯微鏡首次觀察了在蓋玻片上干燥的細(xì)胞（Gould等，1990）。他們用原子力顯微鏡完成了淋巴細(xì)胞（一種類型的白血細(xì)胞）的檢測，并且曾經(jīng)分辨出細(xì)胞中10nm大小的表面結(jié)構(gòu)特征，其樣品是通過將抗免疫球蛋白抗體沉積到玻璃基底上得到的。

繼Gould等人用原子力顯微鏡觀察了第l個細(xì)胞之后，用原子力顯微鏡對其他多種類型的細(xì)胞的研究也已報道（Butt等，1991；Haberle等，1991）。白血細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及心肌細(xì)胞用原子力顯微鏡已取得較好的圖象。細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)也可以識別（圖2：A、B、C）。

Butt等用原子力顯微鏡對白血細(xì)胞進(jìn)行了成像，在水溶液中的圖象可分辨到12nm和特征，而經(jīng)固定后的紅血及白血細(xì)胞在緩沖液中成像可以分辨到8nm的結(jié)構(gòu)特征。其圖象表明原子力顯微鏡可以提供在生理條件下細(xì)胞表面的高分辨結(jié)果。圖3是他們得到的白血細(xì)胞的圖象。

Haberle等人報道了單個活細(xì)胞的原子力顯微鏡研究（Haberle等，1991）。實驗過程是在適當(dāng)?shù)纳項l件下，維持細(xì)胞具有活性的情況下進(jìn)行的。他們首次使對紅血細(xì)胞的觀察在該條件下達(dá)到10nm的分辨率，這種圖象中觀察到的結(jié)構(gòu)基本與從干燥細(xì)胞觀察到的結(jié)果相同。

固定化的白血細(xì)胞的AFM圖象

圖3 ?固定化的白血細(xì)胞的AFM圖象
Fig.3 ?AFM image of fixed leucocyte

2．染色體的原子力顯微圖象 ?

新近Putman等人用原子力顯微鏡獲得了整個染色體的圖象（圖2:D）（Putman等，1992），從圖2：D可明顯看到，染色體呈X型的“四臂結(jié)構(gòu)”，染色體中的一些亞結(jié)構(gòu)在一定程度上可以被識別.

3．細(xì)胞中分子和細(xì)胞膜的成像

細(xì)胞中的一些蛋白質(zhì)分子曾經(jīng)用AFM成像過。其中包括免疫球蛋白（immunoglobulins），血纖維蛋白（fibrin），磷酸化酶（phosphorylase）及肌動纖維（actin）（Drake等，1989；Edstrom等，1990；Weisenhorn等，1990），用AFM可以分辨出一些亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。盡管成像作用力、蛋白質(zhì)運動及脫水作用很可能是影響分辨率的重要因素，但目前蛋白質(zhì)成像分辨較低的原因仍然很難被完全理解。蛋白質(zhì)鑲嵌在細(xì)胞膜上（如離子通道和受體）可能帶來一些好處，在這種條件下，蛋白質(zhì)可以通過膜來支撐。紫膜（purple membranes）上的細(xì)菌視紫紅質(zhì)已獲得高分辨的圖象（Butt等，1990）。Devaud 等在細(xì)菌S-層上已檢測到蛋白質(zhì)排列（array）中的缺陷，1991年Hoh等人曾經(jīng)得到過能彼此分開的一種稱為“Gap junction”（縫隙連結(jié)）的圖象（圖4：A、B）（Hoh等，1991）。圖象很明顯類似于負(fù)染色的電鏡結(jié)果，他們的結(jié)果與過去對這種結(jié)構(gòu)的觀察結(jié)果相比有明顯的改善。

分子和膜的AFM圖象

圖4 ?分子和膜的AFM圖象

Fig.4 ?AFM image of molecule and membrane

A：磷酸緩沖液中“gap junction”膜通道細(xì)胞外表面的AFM象（80nm×80nm）；
B：“gap junction”邊緣的表面圖象，在通道排列中從右邊的磷脂雙層到左邊的凸起為1—2nm（圖中尺寸以nm為單位）.

在其他生物分子中，最引人注意的是脂質(zhì)和核酸。脂質(zhì)和脂肪酸已在各種人工L-B膜中成像過。單個分子的頭部基團(tuán)（head group）和尾部基團(tuán)（tail group）已可以分辨。高度結(jié)晶化的膜的疏水末端可以在空氣中成像（Meyer等，1991），而極性頭部基團(tuán)則要求水環(huán)境（Zasadzinski等，1991；Egger 等，1990）。目前，天然膜中單個脂質(zhì)分子尚未觀察到。成像流動體膜中的細(xì)節(jié)結(jié)構(gòu)是一個重要的問題。

若干年來，有幾個研究小組一直致力于用掃描隧道顯微鏡及原子力顯微鏡來研究DNA結(jié)構(gòu)的工作，或許能夠用來進(jìn)行DNA的測序。新近，可靠地沉積和成像質(zhì)粒DNA的方法已取得進(jìn)展（Bustamnante等，1992，Hansma等，1992），但主要限于在離體的胞外進(jìn)行的研究。

細(xì)胞水平上的動態(tài)現(xiàn)象觀察

1．病毒穿過細(xì)胞膜的動態(tài)過程的觀察

1992年Haberle等成功地用AFM直接觀察到活細(xì)胞中發(fā)生的生物學(xué)過程（Haberle等，1992）。實驗是在生理條件下進(jìn)行的，該實驗實現(xiàn)了用AFM在其它技術(shù)所不能達(dá)到的尺度上進(jìn)行原位觀察。猴腎活細(xì)胞在生長條件下進(jìn)行成像，并可觀察到10nm的可重復(fù)結(jié)構(gòu)特征。當(dāng)加入1個牛痘（pox）病毒時，在不同細(xì)胞的不同實驗中可重復(fù)地觀察到細(xì)胞膜的特征變化。在加入病毒之后，細(xì)胞表面立即變軟。2h后明顯的在細(xì)胞膜外長出，然后這種突起又突然消失。圖5是他們拍攝到的最為特征的病毒穿過細(xì)胞膜的動態(tài)過程，這種現(xiàn)象僅在細(xì)胞被感染后才觀察到。他們將其解釋為與病毒繁殖有關(guān)的蛋白胞泄過程。

病毒穿過細(xì)胞膜的動態(tài)過程

?

圖5. 細(xì)胞受到病毒感染約19h后所觀察到的胞泄過程

Fig.5 Exocytosis process of cells infected by viruses

一種異常的”指狀“（finger立刻）結(jié)構(gòu)可以觀察到一個“隆起”（protrusion）在一端出現(xiàn)，約3min后消失

2．細(xì)胞生長過程中胞內(nèi)結(jié)構(gòu)變化觀察

新近Henderson等用原子力顯微鏡成功地觀察到活細(xì)胞中的纖維狀肌動蛋白的形態(tài)（Henderson等，1992）。圖6是他們所得到的XRL細(xì)胞中的細(xì)節(jié)結(jié)構(gòu)，這是其中的肌動蛋白的原子力顯微圖象。更有意思的是，他們成功地觀察到其中XRL細(xì)胞在40min生長過程中的邊界及內(nèi)部F-肌動蛋白的許多形態(tài)變化，這些變化如圖6所示。斑點可作為靜止位置的標(biāo)記，如在8min時及16min時框圖中的箭頭所示，在8min的時間間隔內(nèi)，兩根纖維之間的空間增加3μm，根據(jù)細(xì)胞邊緣下面的白色斑點位置，細(xì)胞的真正運動可相對地?fù)?jù)此來進(jìn)行確定。

XRL細(xì)胞中F-肌動蛋白的AFM圖象

圖6.?XRL細(xì)胞中F-肌動蛋白的AFM圖象（標(biāo)尺=50nm）

Fig.6 ?AFM image of F-actin in XRL cells（bar=50nm）

現(xiàn)狀及展望

原子力顯微鏡已經(jīng)在研究細(xì)胞、亞細(xì)胞水平的結(jié)構(gòu)取得了成功。它可以在大氣下對細(xì)胞進(jìn)行成像，并且不用重金屬進(jìn)行覆蓋，因此與常規(guī)的透射電鏡和掃描電鏡相比有其優(yōu)點。但是目前用原子力顯微鏡來成像細(xì)胞結(jié)構(gòu)還沒有達(dá)到足夠高的分辨率。其主要原因可能與生物材料的柔性有關(guān)。將樣品固定到原子力顯微鏡可以進(jìn)行測量的表面上，這仍然是一個值得研究的問題，解決這個問題的一般方法尚待發(fā)展。如果要在成像細(xì)胞結(jié)構(gòu)或生物分子時仍然保持其功能，則需要在非變性條件下作剛性固定（rigid archoring）。盡管原子力顯微鏡在研究生物材料方面目前尚未達(dá)到盡善盡美的地步，但其潛在的能力具有相當(dāng)誘人的前景。

原子力顯微鏡的最突出的功能就是能夠?qū)崟r地跟蹤過程，目前原子力顯微鏡的成像通常需要10—100s，它可以用來觀察RNA的翻譯或細(xì)胞的分裂之類的快速過程。這種能力的有力證明就是對與凝血酶有關(guān)的血纖維質(zhì)的聚合過程的觀察（Drake等，1989）。

利用原子力顯微鏡來進(jìn)行成像固然是其最重要的用途，可是其他方面的應(yīng)用也十分重要，尤其是微加工。已經(jīng)有幾個研究組報道，用原子力顯微鏡可以使蛋白質(zhì)在云母表面上移動，在人工脂膜上可以制作納米尺寸的洞穴（Hansma等，1991）。對于由兩個并生雙層（apposed ?bilayers）組成的隔開的聯(lián)結(jié)空隙處，用原子力顯微鏡針尖可以將其中的1個雙層切去（Hoh等，1991）。最近，利用AFM，質(zhì)粒DNA已被剪切成特殊的尺寸而與其序列無關(guān)。也許這會產(chǎn)生一些分子克隆或DNA測序的新方法。如果將活性分子如蛋白酶或抗體連接到針尖上，將會使原子力顯微鏡發(fā)展成為超越單純機(jī)械加工的工具，從而用在局域化學(xué)或生物化學(xué)中（local chemistry and biochemistry）。

當(dāng)原子力顯微鏡用1個尖銳的針尖與表面接觸時，它使我們不僅可以測定表面的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，而且會指出這種作用力特性的問題，關(guān)于界面間分子作用力的理解，Israelachvili及其同事已有報道。它使用的是表面測力儀（surface force apparatns）。表面測力儀通過將兩個表面靠近并測定相互作用與間距之間的關(guān)系，它已被用來檢測水合作用及受體（Israelachvili等，1983）-配體間的結(jié)合（Leckband等，1992）。原子力顯微鏡有可能提供類似于表面測力儀的測定技術(shù)，但原子力顯微鏡不僅可以在很小的接觸面積上做許多相似的測量，并且?guī)в邢喈?dāng)高的空間分辨率（Landman等，1990）。這將會取得細(xì)胞膜及分子的許多物理及化學(xué)性質(zhì)的高分辨圖譜。

原子力顯微鏡已經(jīng)以驚人的速度取得進(jìn)展，其發(fā)明后才6年的時間，就已經(jīng)在技術(shù)科學(xué)與材料科學(xué)研究中成為人們公認(rèn)的重要工具。這幾年由于物理學(xué)家與工程師對儀器研制的貢獻(xiàn)，使其從實驗室的胚胎中發(fā)展成為成像剛性樣品的可靠工具。以后幾年對于生物學(xué)家及生物化學(xué)家來說，更好地成像軟樣品是需要努力的重要任務(wù)。

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  30. The basic principle of AFM is described here briefly. Applications of AFM in imaging cell, cellular organels, chromosome, cell membrance are reviewed. Two interesting examples about dynamic process taken place in cell are given.

Key words

?AFM, Cell, Structure, Imaging, Dynamics

作者簡介

白春禮，研究員，國家級有突出貢獻(xiàn)的中、青年專家，全國先進(jìn)工作者。

主要著作有《掃描隧道顯微術(shù)及其應(yīng)用》等。先后在國內(nèi)外學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表論文50余篇。研制成功計算機(jī)控制的掃描隧道顯微鏡（STM），獲1990年國家科技進(jìn)步二等獎；繼又研制成功我國第一臺原子力場顯微鏡（AFM），獲中國科學(xué)院1991年科技進(jìn)步一等獎?！捌摺の濉逼陂g承擔(dān)中國科學(xué)院“重中之重”項目，中國科學(xué)院院長基金特別支持項目?！鞍恕の濉逼陂g又承擔(dān)中國科學(xué)院“八·五”重大項目——表面、界面和大分子結(jié)構(gòu)的掃描隧道顯微學(xué)研究。