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煙草花葉病毒結(jié)構(gòu)的原子力顯微鏡研究

張平城??白春禮??成英俊??吳浚瀚

戴長春??王中懷??方??曄

摘要

取5μl溶解在20mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.0）中的煙草花葉病毒（0. 2mg/ml），將其滴加在新鮮剝離的云母表面上，然后用0.5％的磷鎢酸染色。所得樣品在大氣下用原子力顯微鏡進(jìn)行成像，用AFM可以清楚地觀察到棒狀的TMV拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，用磷鎢酸染色后的TMV樣品能穩(wěn)定地吸附在新鮮剝離的云母表面上，可靠的TMV的AFM像在大氣下可容易地獲得。

關(guān)鍵詞

原子力顯微鏡，煙草花葉病毒，結(jié)構(gòu)，成像，染色

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在生物學(xué)發(fā)展的歷史過程中，顯微鏡長期以來是研究細(xì)胞、病毒及生物大分子的形態(tài)及結(jié)構(gòu)的重要工具。掃描隧道顯微鏡的研制成功是顯微學(xué)上的一場革命。它導(dǎo)致了一系列掃描探針顯微鏡[原子力顯微鏡（AFM）、激光力顯微鏡（LAFM）、磁力顯微鏡（MFM）、彈道電子發(fā)射顯微鏡（BEEM）、光子掃描隧道顯微鏡（PSTM）]的誕生（白春禮，1992）。這些儀器通過一個探針接近被測物體的表面，從而取得其表面在空間分辨上的某些特性信息。如隧道電流（tunneling current）、相互作用力（interaction force）、離子電導(dǎo)性（ion conductance）、溫度（temperature）等。在這一系列用于生物學(xué)研究的儀器中，最有前途的應(yīng)首推原子力顯微鏡（Binnig等，1986；Rugar等，1990；Hansma等，1992）。

煙草花葉病毒呈現(xiàn)為長300nm，直徑18nm的圓柱形結(jié)構(gòu)，其中心含有1個約4nm的溝槽（Namba等，1989）。這種病毒由2130個相同的蛋白亞基組成，每個亞基包含158個氨基酸殘基，病毒蛋白外殼圍繞一個約6400個核苷酸的單股RNA形成。圍繞單股RNA的蛋白亞基具有螺旋形結(jié)構(gòu)，其螺距為2.3nm（Stubbs?等，1974）。

本文采用本實驗室新近研制成功的激光檢測原子力顯微鏡，對吸附在新鮮剝離的云母表面上的煙草花葉病毒的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了成像。

材料及方法

煙草花葉病毒樣品由Witz博士提供。該病毒懸浮在20mmol/L的磷酸緩沖液（pH 7.0）中，病毒濃度為0.2mg/ml，將1滴上述溶液（大約為5-10μl）滴加到新鮮剝離的云母表面上，約1min后，用一小濾紙條沿液滴的邊緣將殘液吸干，然后立即加5μl濃度為0.5％的磷鎢酸溶液（使用前用氫氧化鈉溶液將酸堿度調(diào)至pH 7.0）于吸附的TMV樣品上，時間約為1min，此后用濾紙條將殘余的磷鎢酸染色液吸去，經(jīng)過上述步驟處理的TMV樣品用AFM成像。

研究中采用的AFM裝置將另文詳細(xì)描述（吳浚瀚等，1992），微懸臂的偏轉(zhuǎn)可以敏感地通過測量在位置敏感檢測器上的反射激光光束的位置變化檢測出來。所有結(jié)果均在大氣下室溫成像得到。圖像采用恒力模式測量，氮化硅微懸臂采用Digital In tuments Inc.產(chǎn)品，其力常數(shù)K為0.12N/m（200μm長度），帶有錐形的針尖，圖象尺寸通過采用同一微懸臂對云母成像后進(jìn)行定標(biāo)。AFM圖象數(shù)據(jù)用180×180點陣存貯。除非特別聲明，所給圖象均為未經(jīng)濾波處理的原始數(shù)據(jù)。

結(jié)果及討論

用前述方法（見材料及方法部分）制備的TMV樣品用AFM進(jìn)行成像。對于濃度為0.2mg/ml的TMV病毒顆粒，所得的AFM圖象如圖1所示，相互分開的單個病毒顆?？梢郧宄赜^察到?？梢?，該樣品濃度是較合適的。TMV分子的分布既不太密也不太稀，并且很容易在吸附基底表面上找到。圖中單個病毒顆粒的長度約為533nm，寬度為50—80nm之間，長度大約比單個TMV分子的實際長度長兩倍，這種結(jié)構(gòu)實際上是很容易理解的，因為TMV分子很容易通過末端之間的相互粘附而形成更長的顆粒，這種形態(tài)類似于用TEM獲得的結(jié)果（Namba等，1989）。用AFM所觀察到的TMV顆粒的寬度大約為TEM結(jié)果的3—5倍（Namba等，1989）,這種明顯的增寬效應(yīng)類似于Vensenka等（1992）及Bustamante等（1992）對DNA成像的結(jié)果。在他們的報道中，用AFM所觀察到的DNA的表觀寬度為10—15nm，大約為DNA的實際螺旋直徑的5—7倍。

在本文中，TMV分子中的中心溝槽沒有觀察到，由蛋白亞基堆積形成的螺旋結(jié)構(gòu)的螺距也不能通過AFM實驗加以識別。很可能有若干種因素限制了AFM對生物材料成像的分辨率，如AFM成像的針尖銳度不夠；生物材料的柔性降低了AFM觀察的分辨率；大量的磷鎢酸染色劑分子沉積在TMV顆粒上，使其精細(xì)結(jié)構(gòu)的分辨造成困難。針尖太鈍、生物材料的柔性以及鹽的沉積這3個因素是造成TMV顆粒的表觀寬度大大加寬的重要原因。

煙草花葉病毒（TMV）的AFM圖象

圖1??煙草花葉病毒（TMV）的AFM圖象

Fig.1 AFM of tobacco mosaic virus

TMV吸附在新鮮剝離的云母表面上，然后用0.5%的磷鎢酸染色，掃描范圍為1807nm×2900nm。圖中3個相互分開的單個TMV顆?？梢郧宄赜^察到，顆粒長度大約為533 nm?，可能為兩個TMV分子通過末端粘結(jié)形成的二聚體。

另一區(qū)域煙草花葉病毒（TMV）的AFM圖象

圖2??在另一掃描區(qū)域獲得的TMV圖象

Fig.2??TMV obtained in other?scanning region

掃描范圍為1807nm×2900nm。單個病毒顆粒仍然可以分清，有的病毒分 子粘結(jié)成更長的顆粒。
煙草花葉病毒的AFM圖象

圖3 ?煙草花葉病毒的AFM?圖象

Fig.3 ?AFM of tobaccomosaic virus

制樣條件與圖1相同，在圖中可以看到相互重疊的TMV顆粒，右下角最短的病毒顆粒長度約為368nm，接近于單個TMV分子的長度。

圖2 和圖3 分別是在兩個不同掃描區(qū)域中對染色的TMV顆粒進(jìn)行觀察所得的AFM圖象。根據(jù)前述方法（見材料及方法部分）制得的樣品，可以觀察到彼此分開或相互重疊的TMV分子，并且圖1、2、3 中的TMV圖象是很穩(wěn)定、易重復(fù)的。我們曾經(jīng)用染色及不染色兩種方法制備了TMV樣品，然后對其進(jìn)行成像。結(jié)果對于不染色的樣品，較難找到穩(wěn)定吸附的TMV圖象，而染色后的樣品，則較易成像和重復(fù)。磷鎢酸可能對TMV分子在云母表面上的吸附有穩(wěn)定作用，結(jié)果使其在針尖掃描時不易發(fā)生移動。磷鎢酸的染色同樣可能有利于增加病毒的剛性。在圖1 至3實驗中，我們總是采用新鮮剝離的云母表面作為基底，它具有明顯的親水性，很顯然，這是有利于TMV分子在云母表面上吸附的。由上我們可以推測，TMV的染色及采用新鮮剝離的云母可能是獲得穩(wěn)定可重復(fù)的AFM圖象的兩個重要因素。盡管可靠的成像生物材料（如TMV病毒）已不成問題，但要增加分辨率來分辨單個分子中的精細(xì)結(jié)構(gòu)尚需作許多努力。

致謝

我們十分感謝Witz博士及Engel教授提供的TMV樣品。

參考文獻(xiàn)

  • 白春禮，1992，掃描隧道顯微鏡及其應(yīng)用，上?？茖W(xué)出版社，91-132.
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  • Bustamante C, Vesenka J, Tang C L et al. 1992. Biochemistry, 31: 22-26.
  • Hansma H G, Vesenka J, Siegerist C et al. 1992. Science, 256: 1180-1184.
  • Namba K, Pattanayek R, Stubbs G. 1989. J. Mol. Biol., 208: 307.
  • Rugar D, Hansma P. 1990. Physics Today,23-30.
  • Stubbs G J. 1974. Acta Cryst., A 30: 639.
  • Vesenka J, Guthold M, Tang C L et al. 1992. Ultramicroscopy, 42-44: 1243-1249.

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Tobacco Mosaic Virus Observed with?Atomic Force Microscope

Zhang Pingcheng，Bai Chunli，Cheng Yingjun，Wu Junhan，Dai Changchun，Wang Zhonghuai，F(xiàn)ang Ye

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Abstract

Tobacco mosaic virus (TMV) suspended in 20 mmol/L phosphate buffer, pH 7, at concentration of 0.2mg/m1 was deposited on freshly cleaved mica surface, then stained with 0.5% buffered phosphotunstic acid solution. The TMV samples treated by the above procedures were d with AFM in ?air at room temperature. The structure of TMV d with AFM were analyzed and discussed.

Key words

AFM, TMV, Structure, Imaging, Staining