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煙草花葉病毒結(jié)構(gòu)的原子力顯微鏡研究

張平城??白春禮??成英俊??吳浚瀚

戴長(zhǎng)春??王中懷??方??曄

摘要

取5μl溶解在20mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.0）中的煙草花葉病毒（0. 2mg/ml），將其滴加在新鮮剝離的云母表面上，然后用0.5％的磷鎢酸染色。所得樣品在大氣下用原子力顯微鏡進(jìn)行成像，用AFM可以清楚地觀察到棒狀的TMV拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，用磷鎢酸染色后的TMV樣品能穩(wěn)定地吸附在新鮮剝離的云母表面上，可靠的TMV的AFM像在大氣下可容易地獲得。

關(guān)鍵詞

原子力顯微鏡，煙草花葉病毒，結(jié)構(gòu)，成像，染色

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在生物學(xué)發(fā)展的歷史過(guò)程中，顯微鏡長(zhǎng)期以來(lái)是研究細(xì)胞、病毒及生物大分子的形態(tài)及結(jié)構(gòu)的重要工具。掃描隧道顯微鏡的研制成功是顯微學(xué)上的一場(chǎng)革命。它導(dǎo)致了一系列掃描探針顯微鏡[原子力顯微鏡（AFM）、激光力顯微鏡（LAFM）、磁力顯微鏡（MFM）、彈道電子發(fā)射顯微鏡（BEEM）、光子掃描隧道顯微鏡（PSTM）]的誕生（白春禮，1992）。這些儀器通過(guò)一個(gè)探針接近被測(cè)物體的表面，從而取得其表面在空間分辨上的某些特性信息。如隧道電流（tunneling current）、相互作用力（interaction force）、離子電導(dǎo)性（ion conductance）、溫度（temperature）等。在這一系列用于生物學(xué)研究的儀器中，最有前途的應(yīng)首推原子力顯微鏡（Binnig等，1986；Rugar等，1990；Hansma等，1992）。

煙草花葉病毒呈現(xiàn)為長(zhǎng)300nm，直徑18nm的圓柱形結(jié)構(gòu)，其中心含有1個(gè)約4nm的溝槽（Namba等，1989）。這種病毒由2130個(gè)相同的蛋白亞基組成，每個(gè)亞基包含158個(gè)氨基酸殘基，病毒蛋白外殼圍繞一個(gè)約6400個(gè)核苷酸的單股RNA形成。圍繞單股RNA的蛋白亞基具有螺旋形結(jié)構(gòu)，其螺距為2.3nm（Stubbs?等，1974）。

本文采用本實(shí)驗(yàn)室新近研制成功的激光檢測(cè)原子力顯微鏡，對(duì)吸附在新鮮剝離的云母表面上的煙草花葉病毒的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了成像。

材料及方法

煙草花葉病毒樣品由Witz博士提供。該病毒懸浮在20mmol/L的磷酸緩沖液（pH 7.0）中，病毒濃度為0.2mg/ml，將1滴上述溶液（大約為5-10μl）滴加到新鮮剝離的云母表面上，約1min后，用一小濾紙條沿液滴的邊緣將殘液吸干，然后立即加5μl濃度為0.5％的磷鎢酸溶液（使用前用氫氧化鈉溶液將酸堿度調(diào)至pH 7.0）于吸附的TMV樣品上，時(shí)間約為1min，此后用濾紙條將殘余的磷鎢酸染色液吸去，經(jīng)過(guò)上述步驟處理的TMV樣品用AFM成像。

研究中采用的AFM裝置將另文詳細(xì)描述（吳浚瀚等，1992），微懸臂的偏轉(zhuǎn)可以敏感地通過(guò)測(cè)量在位置敏感檢測(cè)器上的反射激光光束的位置變化檢測(cè)出來(lái)。所有結(jié)果均在大氣下室溫成像得到。圖像采用恒力模式測(cè)量，氮化硅微懸臂采用Digital In tuments Inc.產(chǎn)品，其力常數(shù)K為0.12N/m（200μm長(zhǎng)度），帶有錐形的針尖，圖象尺寸通過(guò)采用同一微懸臂對(duì)云母成像后進(jìn)行定標(biāo)。AFM圖象數(shù)據(jù)用180×180點(diǎn)陣存貯。除非特別聲明，所給圖象均為未經(jīng)濾波處理的原始數(shù)據(jù)。

結(jié)果及討論

用前述方法（見(jiàn)材料及方法部分）制備的TMV樣品用AFM進(jìn)行成像。對(duì)于濃度為0.2mg/ml的TMV病毒顆粒，所得的AFM圖象如圖1所示，相互分開(kāi)的單個(gè)病毒顆?？梢郧宄赜^察到?？梢?jiàn)，該樣品濃度是較合適的。TMV分子的分布既不太密也不太稀，并且很容易在吸附基底表面上找到。圖中單個(gè)病毒顆粒的長(zhǎng)度約為533nm，寬度為50—80nm之間，長(zhǎng)度大約比單個(gè)TMV分子的實(shí)際長(zhǎng)度長(zhǎng)兩倍，這種結(jié)構(gòu)實(shí)際上是很容易理解的，因?yàn)門(mén)MV分子很容易通過(guò)末端之間的相互粘附而形成更長(zhǎng)的顆粒，這種形態(tài)類似于用TEM獲得的結(jié)果（Namba等，1989）。用AFM所觀察到的TMV顆粒的寬度大約為T(mén)EM結(jié)果的3—5倍（Namba等，1989）,這種明顯的增寬效應(yīng)類似于Vensenka等（1992）及Bustamante等（1992）對(duì)DNA成像的結(jié)果。在他們的報(bào)道中，用AFM所觀察到的DNA的表觀寬度為10—15nm，大約為DNA的實(shí)際螺旋直徑的5—7倍。

在本文中，TMV分子中的中心溝槽沒(méi)有觀察到，由蛋白亞基堆積形成的螺旋結(jié)構(gòu)的螺距也不能通過(guò)AFM實(shí)驗(yàn)加以識(shí)別。很可能有若干種因素限制了AFM對(duì)生物材料成像的分辨率，如AFM成像的針尖銳度不夠；生物材料的柔性降低了AFM觀察的分辨率；大量的磷鎢酸染色劑分子沉積在TMV顆粒上，使其精細(xì)結(jié)構(gòu)的分辨造成困難。針尖太鈍、生物材料的柔性以及鹽的沉積這3個(gè)因素是造成TMV顆粒的表觀寬度大大加寬的重要原因。

煙草花葉病毒（TMV）的AFM圖象

圖1??煙草花葉病毒（TMV）的AFM圖象

Fig.1 AFM of tobacco mosaic virus

TMV吸附在新鮮剝離的云母表面上，然后用0.5%的磷鎢酸染色，掃描范圍為1807nm×2900nm。圖中3個(gè)相互分開(kāi)的單個(gè)TMV顆?？梢郧宄赜^察到，顆粒長(zhǎng)度大約為533 nm?，可能為兩個(gè)TMV分子通過(guò)末端粘結(jié)形成的二聚體。

另一區(qū)域煙草花葉病毒（TMV）的AFM圖象

圖2??在另一掃描區(qū)域獲得的TMV圖象

Fig.2??TMV obtained in other?scanning region

掃描范圍為1807nm×2900nm。單個(gè)病毒顆粒仍然可以分清，有的病毒分 子粘結(jié)成更長(zhǎng)的顆粒。
煙草花葉病毒的AFM圖象

圖3 ?煙草花葉病毒的AFM?圖象

Fig.3 ?AFM of tobaccomosaic virus

制樣條件與圖1相同，在圖中可以看到相互重疊的TMV顆粒，右下角最短的病毒顆粒長(zhǎng)度約為368nm，接近于單個(gè)TMV分子的長(zhǎng)度。

圖2 和圖3 分別是在兩個(gè)不同掃描區(qū)域中對(duì)染色的TMV顆粒進(jìn)行觀察所得的AFM圖象。根據(jù)前述方法（見(jiàn)材料及方法部分）制得的樣品，可以觀察到彼此分開(kāi)或相互重疊的TMV分子，并且圖1、2、3 中的TMV圖象是很穩(wěn)定、易重復(fù)的。我們?cè)?jīng)用染色及不染色兩種方法制備了TMV樣品，然后對(duì)其進(jìn)行成像。結(jié)果對(duì)于不染色的樣品，較難找到穩(wěn)定吸附的TMV圖象，而染色后的樣品，則較易成像和重復(fù)。磷鎢酸可能對(duì)TMV分子在云母表面上的吸附有穩(wěn)定作用，結(jié)果使其在針尖掃描時(shí)不易發(fā)生移動(dòng)。磷鎢酸的染色同樣可能有利于增加病毒的剛性。在圖1 至3實(shí)驗(yàn)中，我們總是采用新鮮剝離的云母表面作為基底，它具有明顯的親水性，很顯然，這是有利于TMV分子在云母表面上吸附的。由上我們可以推測(cè)，TMV的染色及采用新鮮剝離的云母可能是獲得穩(wěn)定可重復(fù)的AFM圖象的兩個(gè)重要因素。盡管可靠的成像生物材料（如TMV病毒）已不成問(wèn)題，但要增加分辨率來(lái)分辨單個(gè)分子中的精細(xì)結(jié)構(gòu)尚需作許多努力。

致謝

我們十分感謝Witz博士及Engel教授提供的TMV樣品。

參考文獻(xiàn)

  • 白春禮，1992，掃描隧道顯微鏡及其應(yīng)用，上?？茖W(xué)出版社，91-132.
  • Binnig G, Quate C F, Gerber C. 1986. Phys. Rev. Lett., 56: 930-933.
  • Bustamante C, Vesenka J, Tang C L et al. 1992. Biochemistry, 31: 22-26.
  • Hansma H G, Vesenka J, Siegerist C et al. 1992. Science, 256: 1180-1184.
  • Namba K, Pattanayek R, Stubbs G. 1989. J. Mol. Biol., 208: 307.
  • Rugar D, Hansma P. 1990. Physics Today,23-30.
  • Stubbs G J. 1974. Acta Cryst., A 30: 639.
  • Vesenka J, Guthold M, Tang C L et al. 1992. Ultramicroscopy, 42-44: 1243-1249.

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Tobacco Mosaic Virus Observed with?Atomic Force Microscope

Zhang Pingcheng，Bai Chunli，Cheng Yingjun，Wu Junhan，Dai Changchun，Wang Zhonghuai，F(xiàn)ang Ye

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Abstract

Tobacco mosaic virus (TMV) suspended in 20 mmol/L phosphate buffer, pH 7, at concentration of 0.2mg/m1 was deposited on freshly cleaved mica surface, then stained with 0.5% buffered phosphotunstic acid solution. The TMV samples treated by the above procedures were d with AFM in ?air at room temperature. The structure of TMV d with AFM were analyzed and discussed.

Key words

AFM, TMV, Structure, Imaging, Staining