肌動(dòng)蛋白體外自組織復(fù)合纖維結(jié)構(gòu)的觀察

激光生物學(xué)報(bào) ?第13 卷第6 期 2004 年12 月?

張　軍1 ,2 , 王遠(yuǎn)亮1 , 何創(chuàng)龍1 , 程　超1 , CHEN Xin-yong3

　(1. 重慶大學(xué)教育部生物力學(xué)及組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國重慶400044 ; 2. 重慶醫(yī)科大學(xué)生物學(xué)教研室,中國重慶400016; 3. Laboratory of Biophysics and Surface Analysis , University of Nottingham , Nottingham NG7 2RD , United Kingdom)?

摘要

? ? ? ?利用原子力顯微鏡(atomic force microscope , AFM) 和透射電子顯微鏡(transmission electron microscope , TEM) 技術(shù),研究了低濃度肌動(dòng)蛋白在體外簡單熱力學(xué)體系中,形成的自組織復(fù)合纖維結(jié)構(gòu)。肌動(dòng)蛋白在體外通過自組織過程能夠聚合形成大尺度的、離散的、復(fù)雜的聚集纖維體系,分散的單根微絲較少;在微絲穩(wěn)定劑鬼筆環(huán)肽干預(yù)下,肌動(dòng)蛋白通過受調(diào)控的自裝配過程,主要形成分散的單根微絲,以及少量由單根微絲組成的微絲束和纖維分支等簡單微絲聚集結(jié)構(gòu)。

關(guān)鍵詞

肌動(dòng)蛋白；自組織;復(fù)合纖維結(jié)構(gòu)；原子力顯微鏡；透射電子顯微鏡

?

中圖分類號: Q245 ;Q-334

文獻(xiàn)標(biāo)識碼: A

文章編號: 1007-7146 (2004) 06-0401-05

?

Observation on the Complex Structure of Actin Filaments Forming in Self-organization in vitro?

ZHANG Jun1 ,2 , WANG Yuan-liang1 , HE Chuang-long1 , CHENG Chao1 , Chen Xin-yong3

(1. The Key Lab of Biomechanics &Tissue Engineering , Ministry of Education , Chongqing University , Chongqing 400044 , China ;2. Biology Department of Chongqing University of Medicine Sciences , Chongqing 400016 , China : 3. Laboratory of Biophysics and Surface Analysis , University of Nottingham , Nottingham NG7 2RD , United Kingdom)

Abstract

The transmission electron microscope and the atomic force microscope - the novel tool for surface structure exploration ,are employed to examine the structure of actin filaments forming in self-organization in vitro. It is observed that the actin can be po-lymerized into discrete and complicated filament complexes of tree-like branch structure and random coil filaments cluster in large scale in the simple thermodynamic solution without the addition of F-actin stabilizing reagents phalloidin. However in the presence of phalloidin , the polymerized filaments are mainly the single F-actin in dispersive distribution , and the intricate filaments made of mi-crofilaments are seldom found under the same experimental conditions.

Key words

actin ; self-organization ; complex structure of filament ; atomic force microscope ; transmission electron microscope?

?

? ? ? ?肌動(dòng)蛋白(Actin) 是真核細(xì)胞內(nèi)最保守、含量最豐富的蛋白質(zhì)之一,作為細(xì)胞骨架和結(jié)構(gòu)的主要成分,具有極其重要的細(xì)胞生理功能[1 ,2 ] 。肌動(dòng)蛋白一般以球形肌動(dòng)蛋白(G-actin) 和纖維性肌動(dòng)蛋白( F-actin , 即微絲) 兩種形式存在。G-actin 的一級序列通常由375 個(gè)氨基酸殘基組成,分子量約為43 KD ,溶液中,在Mg2 + , K+ , Na + ,及ATP 誘導(dǎo)下能自聚合形成高分子量、右手雙螺旋結(jié)構(gòu)的F-actin[3 ,4 ] 。在體內(nèi),F-actin 能夠通過與一系列胞內(nèi)蛋白相互作用,以適應(yīng)不同生理?xiàng)l件下的功能需要[5 ] 。肌動(dòng)蛋白在真核細(xì)胞中擔(dān)負(fù)了多種重要的生理功能[6～15 ] ,是細(xì)胞內(nèi)最重要的蛋白質(zhì)之一,因而自從被發(fā)現(xiàn)以來,其結(jié)構(gòu)及功能研究成為細(xì)胞生物學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的重要內(nèi)容。不僅多種晶體形式的G-actin 原子結(jié)構(gòu)已獲得闡明[16～18 ] ,而且F-actin 的原子結(jié)構(gòu)模型也通過纖維X-射線衍射[19 ,20 ] 和電子顯微鏡成像而得到建立[21～23 ] 。

? ? ? ?但是,纖維性肌動(dòng)蛋白的復(fù)雜聚集結(jié)構(gòu)體系卻極少引起關(guān)注(盡管細(xì)胞內(nèi)的微絲聚集體系—肌纖維和微絨毛的超微結(jié)構(gòu)已得到闡明) 。因而,我們利用原子力顯微鏡(一種已廣泛應(yīng)用于肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)、功能及動(dòng)力學(xué)研究的新型表面結(jié)構(gòu)分析儀器[24 ] ) ,和透射電子顯微鏡,對肌動(dòng)蛋白體外簡單熱力學(xué)體系中形成的自組織復(fù)合纖維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察。

1 材料和方法

1.1 材料

? ? ? ?G-actin 提取自牛骨骼肌,純化按照Spudich 和Watt 等人的方法改良[25 ] 。分離的肌動(dòng)蛋白達(dá)電泳單點(diǎn)純,儲存于4 ℃的G-緩沖液中備用;Na-ATP、DTT 購自Sigma ,Tris-base 、Tris-HCl 購自Promega , 其余試劑均為國產(chǎn)分析純;CSPM-2000we 型原子力顯微鏡為中國科學(xué)院化學(xué)研究所本原納米儀器有限公司生產(chǎn),使用NANOPROBETM NP 型Si3N4 探針。H-600 透射電子顯微鏡為日立公司產(chǎn)品,使用300 目的銅網(wǎng),以醋酸鈾為負(fù)染色劑。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制　G-緩沖液(2 mmolPL Tris-Cl , pH7. 5 , 0. 2 mmolPL CaCl2 , 0. 5 mmolPL DTT , 0. 2 mmolPLATP) 和F-緩沖液(5 mmolPL Tris-Cl , pH 7. 5 , 2 mmolPLMgCl2 , 100 mmolPL KCl , 1 mmolPL DTT , 1 mmolPLATP) 均按常規(guī)方法制備,所有使用的溶劑和新鮮配制的溶液均通過直徑0. 22 μm 的濾膜過濾去除顆粒。

1.2.2 原子力顯微鏡樣品制備　用F-緩沖液將1ml 純化G-actin 精確稀釋至100 ml ,使溶液中G-actin的最終濃度為5μgPml ,然后將樣品置于37 ℃恒溫箱中孵育30 min 使其聚合。聚合完成后,在新鮮剝離的、經(jīng)F-緩沖液浸潤的云母表面(1 cm ×1 cm) 滴加5 μl 待測溶液,使蛋白能夠良好分散。沉降15min 后,自然脫水以盡可能維持肌動(dòng)蛋白真實(shí)的聚合結(jié)構(gòu),制成待測樣品。

1.2.3 原子力顯微鏡成像　樣品制備完成后不經(jīng)過任何物理和化學(xué)處理,立即在室溫下(25℃) 用原子力顯微鏡的接觸模式成像。原子力顯微鏡采集的圖像保存為BMP 格式,儲存在電腦中做進(jìn)一步的分析。上述所有操作均在超凈工作條件下進(jìn)行,以避免污染。

1.2.4 負(fù)染色樣品的制備　實(shí)驗(yàn)組使用普通F-緩沖液,對照組加入過量鬼筆環(huán)肽到F-緩沖液中,使最終溶液中的鬼筆環(huán)肽與球形肌動(dòng)蛋白的分子比達(dá)到5∶1 或以上,使聚合體系中的鬼筆環(huán)肽充分過量;分別用實(shí)驗(yàn)組和對照組的F-緩沖液將1 ml 純化G-actin 精確稀釋至100 ml ,使溶液中G-actin 的最終濃度為5μgPml ,然后將樣品置于37 ℃恒溫箱中孵育30 min 使其聚合。聚合完成后,在300 目的銅網(wǎng)上滴加適量待測溶液。沉降15 min 后,小心吸去多余的液滴,然后按照負(fù)染的常規(guī)方法制成待測樣品。

1.2.5 透射電子顯微鏡觀察　樣品制備完成后,立即按照常規(guī)操作在H-600 (Hitachi) 透射電子顯微鏡上對樣品進(jìn)行觀察和攝影。

2 結(jié)果

2.1 自組織復(fù)合纖維結(jié)構(gòu)的原子力顯微鏡觀察

? ? ? ?肌動(dòng)蛋白在體外通過自組織能夠聚合形成大尺度的樹狀分支纖維叢結(jié)構(gòu)和聚集的、相互纏繞的無規(guī)卷曲纖維簇。目前初步判斷,觀察到的聚集結(jié)構(gòu)可能是由微絲通過非共價(jià)作用(氫鍵,范德華力,靜電作用等等) 進(jìn)一步聚合形成的有序結(jié)構(gòu);推測微絲間的相互纏繞或形成(多級) 螺旋可能是聚集纖維復(fù)合體的主要構(gòu)成方式。

2.1.1 狀分支結(jié)構(gòu)的纖維叢　具有分形結(jié)構(gòu)特征的樹狀分支結(jié)構(gòu),由多級纖維分支形成( Fig.1)。 暗示聚集的纖維結(jié)構(gòu)可能是通過微絲之間相互作用而形成的多級螺旋的纖維復(fù)合體系。推測次級纖維成份之間的相互作用可能在樹狀分支結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生過程中,具有重要的作用,但復(fù)合纖維結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的詳細(xì)聚合動(dòng)力學(xué)機(jī)制還有待于進(jìn)一步的深入研究。

圖1.?樹狀分支結(jié)構(gòu)

Fig.1 Tree-like branch structure

2.1.2 無規(guī)卷曲的纖維簇　在大尺度的范圍內(nèi),還能觀察到大量的纖維互相纏繞、簇集在一起,呈無規(guī)律的卷曲分布狀況(Fig. 2) 。無規(guī)卷曲的纖維簇可能與樹狀分支結(jié)構(gòu)的纖維叢有很強(qiáng)的同源性。二者可能是微絲進(jìn)一步聚合過程中、不同聚集階段的產(chǎn)物,具有不同的空間拓?fù)錁?gòu)象。

圖2.無規(guī)卷曲的纖維簇圖像

Fig.2 Random coil filaments cluster. 1

?2.1.3 自組織纖維結(jié)構(gòu)分支角度的頻數(shù)分析　利用SPSS10. 0 對自組織纖維結(jié)構(gòu)分支角度的頻數(shù)分布進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn),自組織纖維結(jié)構(gòu)分支角度主要分布在35～65 度之間,在這個(gè)分布范圍之外的纖維數(shù)量很少(Fig. 3) 。平均分支角度為52. 08 ±9. 42度,分支角度的大小反映了微絲之間相互作用的能級狀態(tài),集中分布的角度范圍應(yīng)該是微絲間相互作用的最低能量狀態(tài)區(qū)域。

圖3.?分支角度的頻數(shù)分布圖

Fig.3 Frequency distribution of branch angle

2. 2 　復(fù)合纖維結(jié)構(gòu)負(fù)染色的透射電子顯微鏡觀察

? ? ? ?在過量微絲穩(wěn)定劑鬼筆環(huán)肽介入下的肌動(dòng)蛋白體外聚合實(shí)驗(yàn)中,單根微絲為主要的聚合纖維成分,普遍較長,單獨(dú)存在或在沉降過程中形成由取向不同的微絲組成的交聯(lián)結(jié)構(gòu),還能觀察到少量由數(shù)根微絲構(gòu)成的微絲束和纖維分支等簡單聚集結(jié)構(gòu),但觀察不到大尺度的復(fù)雜纖維結(jié)構(gòu)( Fig. 4a) ;肌動(dòng)蛋白體外通過自組織過程主要形成離散的、大尺度的復(fù)雜纖維結(jié)分散的單根微絲很少。具有較粗直徑的長纖維很常見,而且較長的纖維一般直徑較粗,多有分支產(chǎn)生(Fig. 4 b , c) 。肌動(dòng)蛋白自組織纖維結(jié)構(gòu)負(fù)染色的透射電鏡觀察結(jié)果與原子力顯微鏡的結(jié)果完全一致。

圖4.?肌動(dòng)蛋白復(fù)合纖維透射電鏡圖

Fig.4 Images of negatively stained polymerized actin filaments in the presence of phalloidin and in self-organization.

?(a) Image of actin filaments polymerized in the presence of phalloidin ( ×80000) ; (b) , (c) ones in self-organization ( ×80000) . The scale bar represents 100 nm.

3 討論

? ? ? ?肌動(dòng)蛋白在F-緩沖液中,沒有微絲穩(wěn)定劑存在的條件下,能夠通過自組織過程形成大尺度的、離散的復(fù)雜纖維聚集結(jié)構(gòu);而在常規(guī)性微絲工具藥物(穩(wěn)定劑) 鬼筆環(huán)肽介入下,肌動(dòng)蛋白在F-緩沖液中,通過自聚合過程主要形成分散的單根微絲和少量由單根微絲組成的微絲束或纖維分支等簡單微絲聚集體,不能形成復(fù)雜的纖維復(fù)合結(jié)構(gòu)。推測,鬼筆環(huán)肽與微絲結(jié)合后,會占據(jù)肌動(dòng)蛋白空間構(gòu)象的特定位點(diǎn),降低單根微絲的柔韌性[20 ] ,這可能會干擾或抑制微絲間的進(jìn)一步相互作用;而且在鬼筆環(huán)肽存在時(shí),聚合形成的微絲普遍較長,微絲之間通過相互作用產(chǎn)生穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)需要更大的空間位移,使空間位阻增大,進(jìn)一步地阻止了復(fù)雜纖維聚集復(fù)合體的形成。在自組織過程中,肌動(dòng)蛋白聚合形成的具有天然構(gòu)象和適度長度的微絲易于通過相互作用,形成簇集的、大尺度的復(fù)雜纖維聚集結(jié)構(gòu)。細(xì)胞內(nèi),微絲聚集結(jié)構(gòu)———肌纖維和微絨毛均由平行的束狀微絲構(gòu)成,構(gòu)成方式相對簡單。在體外,肌動(dòng)蛋白通過自組織過程形成的聚集纖維結(jié)構(gòu)復(fù)雜得多,形態(tài)與細(xì)胞內(nèi)的聚集結(jié)構(gòu)有明顯的差異,而且其構(gòu)成方式還未能揭示,有待于進(jìn)一步的深入研究。

? ? ? ?肌動(dòng)蛋白自組織動(dòng)力學(xué)及其復(fù)合纖維結(jié)構(gòu)反映了由一級結(jié)構(gòu)所確定的肌動(dòng)蛋白內(nèi)在熱力學(xué)特性。因而,對肌動(dòng)蛋白在體外簡單熱力學(xué)體系中的自組織熱力學(xué)和分子動(dòng)力學(xué)進(jìn)行深入的研究和探索,無疑能夠?yàn)殛U明細(xì)胞內(nèi)與肌動(dòng)蛋白功能密切相關(guān)的聚合動(dòng)力學(xué)調(diào)控機(jī)制提供重要的理論依據(jù)和指導(dǎo),并有助于理解生物大分子動(dòng)力學(xué)、結(jié)構(gòu)多態(tài)性和功能多樣性之間的內(nèi)在聯(lián)系。

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作者簡介

張軍: 男,1973 年10 月出生于四川南充。博士,從事細(xì)胞生物學(xué),穩(wěn)恒磁場生物學(xué)效應(yīng)和抗腫瘤藥物細(xì)胞毒性等領(lǐng)域的研究工作。近5 年來已發(fā)表學(xué)術(shù)論文9 篇,被SCI 收2 篇,CA , CSCD 收錄7 篇。Tel : 65102508(O) ; 65104805(H) ; Fax : (023) 65316247 ;E2mail : zhangjun1017 @sohu. com

Biography

ZHANG Jun : male , born in October 1973 , Nanchong , Sichuan province. He is a Ph. D. , majoring in cell biology , biological effects of static magnetic fields and cytological effect of anti2tumor reagents. He published 9 papers in the recent 5 years , two of which was cited by SCI , and seven by CA , CSCD.