原子力顯微鏡及其在生物學研究中的應用
摘要
原子力顯微鏡自從問世以來在生物學研究中有其不可替代的作用，是生命科學研究中不可缺少的工具。原子力顯微鏡(AFM)技術(shù)本身有許多優(yōu)勢，如樣品制備簡單，可在多種環(huán)境中運作，高分辨率等等。本文主要從生物化學、細胞生物學、免疫學和物質(zhì)超微結(jié)構(gòu)研究等幾個方面對其在生物學中的應用進行綜述。
關(guān)鍵詞
原子力顯微鏡，探針，RNA聚合酶，分子間相互作用
?
原子力顯微鏡(AFM)的優(yōu)勢
原子力顯微鏡(AFM)是80年代初問世的掃描探針顯微鏡(scanning probe microscope，SPM)的一種。1986年，Dr. Binning因發(fā)明掃描探針顯微鏡而獲得諾貝爾物理獎。這種顯微鏡的放大倍數(shù)遠遠超過以往的任何顯微鏡：光學顯微鏡的放大倍數(shù)一般都超不過1000倍；電子顯微鏡的放大倍數(shù)極限為100萬倍；而原子力顯微鏡的放大倍數(shù)能高達10億倍，比電子顯微鏡分辨率高1000倍，可以直接觀察物質(zhì)的分子和原子，這為人類對微觀世界的進一步探索提供了理想的工具。
原子力顯微鏡(AFM)本身的優(yōu)勢是其在生物學中得以迅速發(fā)展的主要原因。首先，原子力顯微鏡(AFM)技術(shù)的樣品制備簡單，無需對樣品進行特殊處理，因此，其破壞性較其它生物學常用技術(shù)(如電子顯微鏡)要小得多；第二，原子力顯微鏡(AFM)能在多種環(huán)境(包括空氣、液體和真空)中運作，生物分子可在生理條件下直接成像，也可對活細胞進行實時動態(tài)觀察；第三，原子力顯微鏡(AFM)能提供生物分子和生物表面的分子/亞分子分辨率的三維圖像；第四，原子力顯微鏡(AFM)能以納米尺度的分辨率觀察局部的電荷密度和物理特性，測量分子間(如受體和配體)的相互作用力；第五，原子力顯微鏡(AFM)能對單個生物分子進行操縱；另外，由原子力顯微鏡(AFM)獲得的信息還能與其它的分析技術(shù)和顯微鏡技術(shù)互補。
原子力顯微鏡(AFM)還具有對標本的分子或原子進行加工的能力，例如，可搬移原子，切割染色體，在細胞膜上打孔等等。綜上所述，原子級的高分辨率、觀察活的生命樣品和加工樣品的力行為成就了原子力顯微鏡的三大特點。
原子力顯微鏡（AFM）原理
原子力顯微鏡(AFM)通常使用氮化硅作為一個靈敏的彈性微懸臂，在其尖端有一個很尖的探針用來在樣品上掃描。點狀物或原子之間的相互作用力通常用Lennard-Jone電位描述:U(r)=-U0[(r0/Z)12-(r0/Z)6]此處Z為原子間距，U0和r0分別為平衡狀態(tài)下原子間的能量和距離。當原子間距小于r0時，原子間作用力由吸引力變?yōu)榕懦饬?。探針與表面之間的吸引力和排斥力被用于掃描力試驗。不同表面方位的探針作用力給出關(guān)于表面形態(tài)和一些其他表面特征的信息。原子力顯微鏡(AFM)有兩種類型：接觸式和非接觸式，分別基于排斥作用和吸引作用。原子力顯微鏡(AFM)試驗中，探針尖端近似為顯微球，則針尖與樣品表面間的作用力為:F(Z)=2πR0B/3Z3，其中Z為針尖與樣品之間的距離，R0為近似顯微球針尖的半徑，B為一個與物體介電常數(shù)有特殊關(guān)系的常量。原子力顯微鏡(AFM)探針安裝在一個靈活的懸臂上，激光二極管發(fā)出的一束激光經(jīng)懸臂反射后，打在一個分裂式光電二極管上，當探針在樣品表面掃描時，由于樣品表面原子結(jié)構(gòu)起伏不平，懸臂也就隨之起伏，于是激光束的反射也就起伏。光電二極管將其接收、放大，即可獲得樣品表面凹凸信息的原子結(jié)構(gòu)圖像。原子量級的表面形態(tài)記錄是原子力顯微鏡(AFM)特有的性能。
輕敲模式(Tapping Mode, TM)成像技術(shù)在用原子力顯微鏡(AFM)觀察柔軟、粘連、易碎的樣品方面,TM成像術(shù)的出現(xiàn)是一個關(guān)鍵性進步。TM-AFM在空氣中掃描時，探針通常以50000～500000次/秒的頻率交替接觸和離開表面。由于針尖接觸表面造成能量損失，懸臂振蕩減弱,這種振幅的減小可以用來鑒別、測量表面狀態(tài)。當針尖通過表面隆起部分時，懸臂在較小空間內(nèi)振蕩，振蕩的振幅同時變??；相反，當針尖通過凹陷處時，懸臂在較大范圍振蕩,振幅變大。數(shù)字反饋回路用來
調(diào)整針尖-樣品間距以維持恒定的振幅和作用于樣品上的力。TM-AFM在液體媒質(zhì)中掃描時，為了避免使整個液體細胞在懸臂振蕩驅(qū)使下進入上下運動狀態(tài), 必須選擇一個合適的振蕩頻率(通常在5000～40000次/秒的范圍內(nèi))。這種方法的特點是：當針尖沿X方向進行掃描時，周期性的使針尖在Z方向上撤離樣品表面然后再接近，并保持每次撤離的距離相等，如果針尖撤離足夠遠，那麼針尖對樣品的橫向作用力就不會被累積，從而可減少針尖對樣品的破壞作用。TM-AFM成像的優(yōu)點在于，它既可以防止針尖與表面粘連和掃描過程中造成的樣品破壞，又能接觸表面并獲得高分辨圖像。而且TM-AFM成像具有廣闊的線性范圍，允許常規(guī)樣品的重復測試。
使用原子力顯微鏡（AFM）觀察生化過程
? ?隨著樣品處理技術(shù)在液體中成像技術(shù)的改善，應用原子力顯微鏡(AFM)觀察復雜的生化過程成為可能。轉(zhuǎn)錄過程是基因表達的中心環(huán)節(jié)，而使用原子力顯微鏡(AFM)觀察蛋白質(zhì)和DNA的相互作用存在一個矛盾要解決：生物分子需要固定到基底上是原子力顯微鏡(AFM)的成像基礎，而生化反應過程卻需要生物分子能相對自由地移動。即使在大量非特異性DNA存在時，RNA聚合酶(RNAP)與啟動子間仍存在很高的結(jié)合率，人們猜想RNAP沿著DNA的擴散是其原因之一。非特異性復合物在適當條件下沉積后，利用原子力顯微鏡(AFM)可觀察到RNAP沿著DNA滑動，且能在不同的DNA片段間轉(zhuǎn)移。然而加入肝素可終止這些過程，這就進一步證實了RNAP- DNA相互作用的非特異性。原子力顯微鏡(AFM)還能對轉(zhuǎn)錄的過程進行實時觀察，在加入核苷酸后，沉積到云母上的延長復合物沿著DNA模板單向移動。兩個對照實驗證實RNAP與DNA的相對移動與轉(zhuǎn)錄的實際情況相符。在一個對照中，以沒有終止子的微環(huán)DNA作為模板，在云母上進行轉(zhuǎn)錄。在干燥后通過原子力顯微鏡(AFM)可觀察到合成的ＲＮＡ長鏈。在第二個對照中，DNA在相同的條件下，在云母上進行轉(zhuǎn)錄。不同的是加入的核苷酸用32Ｐ標記。通過PAGE對反應產(chǎn)物進行分析，結(jié)果顯示與云母結(jié)合的復合物具有活性，而且轉(zhuǎn)錄的速度與用原子力顯微鏡(AFM)測得的近似生物分子的構(gòu)象改變也是原子力顯微鏡(AFM)的重要觀察內(nèi)容。將尿素酶沉積到云母上并用原子力顯微鏡(AFM)掃描，在液池中加入尿素后發(fā)現(xiàn),懸臂的垂直波動明顯增加，這提示由酶活動引起的構(gòu)象改變能直接通過原子力顯微鏡(AFM)記錄下來。格蘭陰性菌的外膜是其保護屏障，它由規(guī)則組裝的蛋白質(zhì)通道構(gòu)成。其中研究較多的是Deinococcusradiodurans的六角形組裝中間體(hexago nallypacked intermediate, HPI)蛋白。HPI被認為與營養(yǎng)的攝入和代謝物的排出有關(guān)。HPI的原子力顯微鏡(AFM)圖像顯示了規(guī)則的六角形及中央的孔樣結(jié)構(gòu)。在液體中成像則發(fā)現(xiàn)HPI呈現(xiàn)出“開和“關(guān)”兩種不同的構(gòu)象。意義雖不清，但這卻顯示出原子力顯微鏡(AFM)在液體中成像的優(yōu)勢。
? ?原子力顯微鏡(AFM)在研究分子識別中的應用分子間的相互作用在生物學領域中相當普遍,例如受體和配體的結(jié)合,抗原和抗體的結(jié)合,信息傳遞分子間的結(jié)合等,是生物體中信息傳遞的基礎。原子力顯微鏡(AFM)可作為一種力傳感器來研究分子間的相互作用。這是由于原子力顯微鏡(AFM)理論上能感應10-14Ｎ的作用力,能感應0.01ｎｍ的位移,而接觸面積可小到10ｎｍ2。因此,原子力顯微鏡(AFM)被用于研究互補的DNA鏈間、細胞粘附分子間及配體-受體間的相互作用力。生物素(biotin)和抗生物素蛋白鏈菌素(streptavidin)間有高親和力,其相互作用的熱力學數(shù)據(jù)也較為清楚。因而,生物素和抗生物素蛋白鏈菌素是原子力顯微鏡(AFM)測定特異相互作用力的良好典型。在一經(jīng)典實驗中，用生物素化的小牛血清白蛋白(biotinlated bovine serum albumin，BBSA)包裹微球，而微球連在懸臂上形成BBSA功能化探針。然后在有生物素阻斷和無生物素阻斷的抗生物素蛋白鏈菌素溶液中測量BBSA功能化探針和BBSA包裹云母間的粘附力。結(jié)果顯示,無生物素阻斷的抗生物素蛋白鏈菌素溶液中需要較大的力才能將BBSA功能化探針與云母表面分離，力的大小為(0.257±0.025)ｎＮ，與分離配體-受體所需的力相符。而在此基礎上可推算出其有效的斷裂距離為(0.95±0.10)ｎｍ。因此，當針尖包裹了特定的分子(如生物素)后,通過針尖和樣品間的相互作用可用于辨認表面的相應分子(如抗生物素蛋白鏈菌素)的位置?，F(xiàn)在已出現(xiàn)了商用的修飾探針，這些探針包裹了不同的分子，可用于不同用途的分子識別。因而原子力顯微鏡將發(fā)揮更廣泛的作用。
? ?原子力顯微鏡(AFM)在物質(zhì)超微結(jié)構(gòu)研究中的應用原子力顯微鏡(AFM)可以直接觀察到表面缺陷、表面重構(gòu)、表面吸附體的形態(tài)和位置、以及有表面吸附體引起的表面重構(gòu)等。原子力顯微鏡(AFM)可以觀察許多不同材料的原子級平坦結(jié)構(gòu)，例如，可以用原子力顯微鏡(AFM)對DL－亮氨酸晶體進行研究，可觀察到表面晶體分子的有序排列，其晶格間距與X射線衍射數(shù)據(jù)相符。另外原子力顯微鏡(AFM)還成功地用于觀察吸附在基底上的有機分子和生物樣品，如，三梨酸、DNA和蛋白質(zhì)的表面。海藻酸聚賴氨酸海藻酸(Alginate Poly L-Lysine Alginate,簡稱APA)膠囊薄膜具有半滲透性，構(gòu)成可以阻止人體免疫系統(tǒng)的成分進入由APA薄膜構(gòu)成的膠囊,從而使得膠囊內(nèi)的物質(zhì)免受免疫系統(tǒng)的侵害。因此,可采用該薄膜膠囊保護人體內(nèi)移植的組織,延長其在人體內(nèi)的存活時間。同時,對藥物具有緩釋效應。APA薄膜的半滲透性同其表面的超微結(jié)構(gòu)有著密切的聯(lián)系,研究其表面的超微結(jié)構(gòu)對其半滲透性的研究具有重要的意義。已有文獻報道了關(guān)于采用原子力顯微鏡(AFM)對APA薄膜的表面結(jié)構(gòu)進行研究的內(nèi)容，發(fā)現(xiàn)了APA表面的特殊結(jié)構(gòu)，從而揭示了APA表面超微結(jié)構(gòu)對半滲透性的重要意義。目前，利用原子力顯微鏡(AFM)已獲得了DNA、透析薄膜、烷烴分子、脂肪酸薄膜以及多糖等的超微結(jié)構(gòu)的圖象。
原子力顯微鏡(AFM)在細胞生物學中的應用
? ?應用原子力顯微鏡(AFM)可研究活細胞或固定細胞如紅細胞、白細胞、細菌、血小板、心肌細胞、活腎上皮細胞及神經(jīng)膠質(zhì)細胞的動態(tài)行為。原子力顯微鏡(AFM)對體外動態(tài)細胞的分析具有非凡的能力。這些研究大都把樣品直接放置在玻片上，不需要染色和固定,樣品制備和操作環(huán)境相當簡單。用免疫膠體金標記細胞膜則打開了細胞表面抗原高分辨定位之門 。原子力顯微鏡(AFM)細胞成像如：用原子力顯微鏡(AFM)研究活腎上皮細胞，可在漿膜小斑上以50nm的分辨率觀察細胞骨架元素、漿膜淺凹和膜結(jié)合絲。用原子力顯微鏡(AFM)觀察血小板的運動,可看到微絲結(jié)構(gòu)、顆粒傳輸?shù)郊毎|(zhì)外側(cè)及活化中細胞成份的再分配。游走上皮細胞的漿膜可用原子力顯微鏡(AFM)實時成像。用原子力顯微鏡(AFM)以50nm的分辨率可觀察水中活的或固定的哺乳動物細胞表面骨架結(jié)構(gòu)，在活細胞中可及時跟蹤細胞構(gòu)形的變化，引入藥物(秋水仙素)導致的細胞骨架結(jié)構(gòu)表面受體交聯(lián)(通過IgE抗體與IgE受體結(jié)合)等,還可描述細胞骨架力的變化。Parpura等用原子力顯微鏡(AFM)觀察神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞在活體狀態(tài)下質(zhì)膜下微絲的運動，由于圖像具有直觀、實時、動態(tài)的特點，從而提出了納米外科學的概念，即對細胞進行納米級的人工操作，以達到對病理細胞進行“手術(shù)”的目的。 應用前景原子力顯微鏡(AFM)技術(shù)在生物學領域的應用有賴于樣品制備方法和適合針尖-樣品相互作用的緩沖液的研究。原子力顯微鏡(AFM)現(xiàn)已成為一種獲得樣品表面結(jié)構(gòu)高分辨率圖像的有力工具。而更為吸引人的是其觀察生化反應過程及生物分子構(gòu)象變化的能力。因此，原子力顯微鏡(AFM)在生物學領域中的應用前景毋庸置疑。而對于原子力顯微鏡(AFM)技術(shù)本身，以下幾個方面的進展將更加有利于它在生物學中的應用。大多數(shù)生物反應過程相當快速，原子力顯微鏡(AFM)時間分辨率的提高有助于這些過程的觀察。生命科學研究有其自身特點,需設計出適合生物學研究的原子力顯微鏡(AFM)。高分辨率是原子力顯微鏡(AFM)的優(yōu)勢。其分辨率在理論上能達到原子水平，但目前還沒有實現(xiàn)，如何作出更細的針尖將有助于其分辨率的進一步提高。而隨著樣品制備技術(shù)的完善，原子力顯微鏡(AFM)必將成為生物學領域中一種常規(guī)的研究工具。
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