海洋紅藻R-藻膽蛋白的掃描隧道顯微鏡研究

張玉忠1* 　周百成1　曾呈奎1　劉　寧2　龐世瑾2

（1．中國科學(xué)院海洋研究所，青島 266071)

（2．中國科學(xué)院北京真空物理實驗室，北京 100080）

摘要

R-藻紅蛋白（R-PE）從海洋紅藻多管藻中分離獲得，然后用掃描隧道顯微鏡對其結(jié)構(gòu)進行了研究。結(jié)果表明當(dāng)R-PE在基底高定向石墨（HOPG）上吸附時，大部分蛋白分子聚集在一起，少數(shù)單個的蛋白分子分布于HOPG的表面。進一步縮小掃描范圍，可以清楚地觀察到R-PE分子為圓盤狀結(jié)構(gòu)，但分子中央的孔洞不象C-藻藍(lán)蛋白那樣清晰，這是由于γ亞基位于分子的中央孔洞內(nèi)。

關(guān)鍵詞

掃描隧道顯微鏡　海洋紅藻　R-藻紅蛋白

藻膽蛋白是紅藻、藍(lán)藻、隱藻和某些甲藻中光合作用中的捕光色素。到目前發(fā)現(xiàn)的藻膽蛋白有四大類, 分別是藻紅蛋白（PE）、藻藍(lán)蛋白（PC）、異藻藍(lán)蛋白（APC）和藻紅藍(lán)蛋白（PEC），其中每一大類又根據(jù)其性質(zhì)的不同分成不同的類型，如藻紅蛋白分成R-藻紅蛋白、C-藻紅蛋白、B-藻紅蛋白和b-藻紅蛋白。藻膽蛋白在光合生物的進化過程中占有極其重要的位置，研究它的結(jié)構(gòu)與功能，對于了解藻類光能吸收與傳遞的機理具有重要的意義。加之藻膽蛋白含量豐富，易于分離，在常溫下非常穩(wěn)定，藻膽蛋白是目前研究的最清楚的光合色素[1]。過去用電子顯微鏡、X-射線衍射等手段對藻膽蛋白的結(jié)構(gòu)進行了大量的研究，到目前為止，已得到六聚體的C-PC[2-4]，三聚體的PEC[5]和六聚體的B-PE[6]的高分辨X-射線衍射結(jié)構(gòu)，但由于電子顯微鏡分辨率較低，而X-射線衍射需首先得到蛋白質(zhì)晶體，因此到目前為止種類繁多的藻膽蛋白僅有為數(shù)很少的幾種得到了X-射線衍射結(jié)果。

掃描隧道顯微鏡（STM）和原子力顯微鏡（AFM）是八十年代初剛發(fā)明的新興的表面分析技術(shù)，已廣泛用于生物學(xué)研究[7]。我們首次將STM應(yīng)用于藻膽蛋白的結(jié)構(gòu)研究，已得到了螺旋C-藻藍(lán)蛋白分子高分辨率的STM圖像[8]，本文報道多管藻R-藻紅蛋白的STM研究結(jié)果。

海洋紅藻多管藻（Poly sip honia urceolata）采自青島匯泉灣畔。將藻體浸在蒸餾水中讓其自溶解，過濾得到藻膽蛋白的粗提液。然后用羥基磷灰石柱層析純化藻膽蛋白。R-藻紅蛋白（R-PE）用20mM的磷酸緩沖液（pH7.0，0.2M NaCl）洗脫，重復(fù)洗脫四次，即得到純化的R-PE。用島津UV-240分光光度計測定吸收光譜。根據(jù)最大吸收峰的OD值計算藻膽蛋白的含量。

在STM實驗之前將藻膽蛋白對5mM（pH7.0）的磷酸緩沖液透析48小時，除去溶液中的NaCl，實驗時將透析液稀釋到大約5μl/ml，吸取5μl樣品溶液滴于剛揭開的高定向石墨（HOPG）上，吸附30s，多余的溶液用濾紙輕輕吸干。STM實驗用中國科學(xué)院化學(xué)研究所生產(chǎn)的CSTM-9100型STM在室溫大氣下進行，采用恒流模式，用電化學(xué)方法自制鎢針尖。掃描時隧道電流為0.70nA，偏壓為256mV。文章中的所有STM圖像都是原始圖像。

圖1是多管藻R-藻紅蛋白的吸收光譜，多管藻的R-PE有三個吸收峰，分別為498nm，545nm和565nm，最大吸收峰565nm處的峰值與278nm處蛋白本身的吸收值之比為3.82，說明這R-PE已經(jīng)純化。

圖2是多管藻R-PE的STM圖像，多個R-PE分子面對面聚集在一起形成類似于藻膽體桿的結(jié)構(gòu)，說明純化的R-藻紅蛋白也傾向于以聚合體的形式存在，這也是生物大分子的共同特性。聚集態(tài)的形成主要取決于R-PE在溶液中的濃度及在HOPG上的吸附時間。在聚集體的邊緣，分布著數(shù)個單個的R-PE分子，分子與分子間的微小差異是由于蛋白分子在HOPG表面上不同的吸附方式所致。

圖1 多管藻R-PE的吸收光譜

圖2 多管藻R-PE的STM圖像

（128nm×128nm）

進一步縮小掃描范圍，可以得到更清晰的R-PE單個分子STM圖像（圖3）。從中可以看出R-PE分子為橢圓盤狀結(jié)構(gòu)，長徑18-20nm，短徑11—13nm，盤狀分子的中央沒有類似于C-PC[8]分子的孔洞，常萬瑞等（1995）[9]根據(jù)X-射線衍射結(jié)果推斷出多管藻R-PE為圓盤狀結(jié)構(gòu)，晶胞參數(shù)a = b = 18.99nm，與STM結(jié)果有點差異，可能由于R-PE分子在HOPG表面吸附時蛋白分子發(fā)生扭曲，加之，在STM掃描過程中由于針尖與樣品間的相互作用，蛋白分子有時會變形。另外，值得注意的是蛋白質(zhì)在晶體狀態(tài)的構(gòu)象與在溶液中的構(gòu)象是否完全一致，還有待于進一步的研究。R-PE的分子聚集態(tài)是 (αβ)6 γ，γ亞基位于 (αβ)6 的中央孔洞里[9] ，使得中央的孔洞不清楚，此外由于R-PE的分子量較大，外形較厚，導(dǎo)致分子的導(dǎo)電性能差，針尖與樣品的相互作用加強，使得分辨率降低，今后用STM研究藻膽蛋白時需進一步改進制樣方法，提高STM圖像的分辨率，以便更好地發(fā)揮STM的優(yōu)勢。

（a）40nm × 70nm ?。╞）25nm × 40nm

圖3 多管藻R-PE的STM圖像

STM和AFM的最大特點是分辨率高、能夠?qū)崟r實空地直接觀察生物大分子（DNA，蛋白質(zhì)等）的結(jié)構(gòu)，可以在空氣、溶液或低溫下進行，使生物大分子保持近似天然的狀態(tài)，使我們能夠在納米尺度上把生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能直接聯(lián)系起來[7]。我們首次將STM應(yīng)用于藻膽蛋白的結(jié)構(gòu)研究，進一步證實了STM的獨特優(yōu)勢。今后結(jié)合蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù)及快速時間分辨光譜技術(shù)，可以用STM來直接觀察藻膽蛋白在光能的吸收與快速傳遞過程中色素基團與蛋白質(zhì)之間的相互作用，為藻膽蛋白的結(jié)構(gòu)、功能與進化的研究開辟新的途徑。

參考文獻

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[2] ?Schirmer T et al. J. Mol. Biol. , 1986, 188∶651-676.

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[4] ?Duerring M et al. J. Mol. Biol. , 1991, 217∶577-592.

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[6] ?Ficner R et al. J. Mol. Bio. , 1993, 228∶935-950.

[7] ?Wiesen danger R. ?Scanning Probe Microsopy and Spectroscopy: Methods and applications Cambridge University Pressm , 1994, P525-536.

[8] ?Zhang et al. J. Vac. Sci Tech. , 1994, B12∶1497-1499.

[9] ?常萬瑞等. 中國科學(xué)(B) , 1995, 25∶49-53.