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激光原子力顯微鏡觀察肌動蛋白體外自組織纖維結(jié)構(gòu)多態(tài)性的初步研究

激光生物學(xué)報(bào) ?第13 卷第4 期 2004 年8 月?

張軍1 ,2 ,王遠(yuǎn)亮1 ,CHEN Xin-yong3 ,何創(chuàng)龍1 ,程超1

(1. 重慶大學(xué)教育部生物力學(xué)及組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國重慶400044 ;2. 重慶醫(yī)科大學(xué)生物學(xué)教研室,中國重慶 400016 ;3. Laboratory of Biophysics and Surface Analysis , University of Nottingham , Nottingham NG7 2RD , United Kingdom)

摘要

利用原子力顯微鏡(atomic force microscope , AFM) 技術(shù),研究了肌動蛋白體外通過自組織過程形成的纖維結(jié)構(gòu)及其多態(tài)性。肌動蛋白在體外通過自組織過程能夠聚合形成離散的樹狀分支的纖維叢和具有不同直徑的長纖維等高級纖維結(jié)構(gòu),表現(xiàn)出明顯的結(jié)構(gòu)多態(tài)性;與微絲工具藥物鬼筆環(huán)肽干預(yù)下自裝配形成的主要由單根微絲和微絲束等纖維成份構(gòu)成的連續(xù)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)明顯不同。

關(guān)鍵詞

肌動蛋白；自組織；結(jié)構(gòu)多態(tài)性；原子力顯微鏡

中圖分類號: Q245 ;Q-334

文獻(xiàn)標(biāo)識碼: A

文章編號: 1007-7146 (2004) 04-0253-05

Preliminary Observation on the Structural Polymorphism of Actin Filaments in Self-organizing in vitro using Laser Atomic Force Microscope

ZHANG Jun1 , 2 , WANG Yuan-liang1 , Chen Xin-yong3 , HE Chuang-long1 , CHENG Chao1

(1. Key Lab of Biomechanics & Tissue Engineering , Ministry of Education , Chongqing University , Chongqing 400044 , China ;

2. Biology Department , Chongqing University of Medicine Sciences , Chongqing 400016 , China : 3. Laboratory of Biophysics and Surface Analysis , University of Nottingham , Nottingham NG7 2RD , United Kingdom)

Abstract

The laser atomic force microscope , a novel tool for surface structure exploration , is employed to investigate the struc-tural polymorphism of actin filaments by self-organization in vitro. It is demonstrated that the actin can be polymerized into tree-like branch structure and long filaments with different diameters in F-buffer without the addition of F-actin stabilizing reagent , such as phalloidin etc. , which is capable of inhibiting the F-actin from depolymerization. These polymerized filaments clearly exhibit the structural polymorphism and show obvious difference from those in the cross-linked network mainly composed of single F-actin and F-actin bundle in the presence of phalloidin under same experimental conditions in previous experiments.

Key words

actin ; self-organization ; structural polymorphism; atomic force microscope

? ? ? ?肌動蛋白(Actin) 是真核細(xì)胞內(nèi)最保守、含量最豐富的蛋白質(zhì)之一,作為細(xì)胞骨架和結(jié)構(gòu)的主要成分,具有極其重要的細(xì)胞生理功能[1 ,2 ] 。肌動蛋白一般以球形肌動蛋白(G-actin) 和纖維性肌動蛋白( F-actin , 即微絲) 兩種形式存在。G-actin 的一級序列通常由375 個(gè)氨基酸殘基組成,分子量約為43KD ,溶液中,在Mg2 + , K+ , Na + 及ATP 誘導(dǎo)下能自聚合形成高分子量、右手雙螺旋結(jié)構(gòu)的F-actin[3 ,4 ] 。在體內(nèi),肌動蛋白不僅作為必需成分參與肌球蛋白介導(dǎo)的肌肉收縮[5 ,6 ] ,并可以通過受調(diào)控的聚合動力學(xué)過程[7 ]或凝膠-溶液轉(zhuǎn)化[8 ] 單獨(dú)介導(dǎo)細(xì)胞運(yùn)動;而且越來越多的研究表明,肌動蛋白參與了遠(yuǎn)比以前人們認(rèn)為的更加廣泛和復(fù)雜的生命活動,如細(xì)胞粘附、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、離子通道調(diào)控等等[9～14 ] 。由于肌動蛋白在真核細(xì)胞中擔(dān)負(fù)了多種重要的生理功能,是細(xì)胞內(nèi)最重要的蛋白質(zhì)之一,因而自從被發(fā)現(xiàn)以來,其結(jié)構(gòu)和功能研究成為細(xì)胞生物學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的重要內(nèi)容。不僅多種晶體形式的G-actin 精細(xì)原子結(jié)構(gòu)已獲得闡明[15～17 ] ,而且高分辨率的F-actin 原子結(jié)構(gòu)模型也通過纖維X-射線衍射[18 ,19 ] 和電子顯微鏡成像而得到建立[20～22 ] ;雖然人們在肌動蛋白高分辨率的結(jié)構(gòu)解析研究中獲得了巨大成功,但是對肌動蛋白體外大尺度結(jié)構(gòu)體系卻關(guān)注較少。而肌動蛋白在體內(nèi)行使正常生理功能時(shí),是依賴于大尺度的超分子結(jié)構(gòu)體系,并非以單個(gè)G-actin 或單根F-actin 來發(fā)揮其細(xì)胞功能。

? ? ? ?為了探索肌動蛋白體外大尺度自聚合結(jié)構(gòu)體系,我們利用原子力顯微鏡———一種已廣泛應(yīng)用于肌動蛋白結(jié)構(gòu)、功能及動力學(xué)研究的新型表面結(jié)構(gòu)分析儀器[23 ] ,對肌動蛋白體外自組織纖維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)肌動蛋白在沒有F-actin 穩(wěn)定劑(如鬼筆環(huán)肽) 存在的情況下,能夠通過自組織過程形成離散的、樹狀分支的纖維叢和具有不同直徑的長纖維結(jié)構(gòu);與Shao Z , 等人實(shí)驗(yàn)中,肌動蛋白在鬼筆環(huán)肽介入下形成由單根微絲和微絲束構(gòu)成的大范圍連續(xù)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)明顯不同[24 ] 。這暗示,作為微絲工具藥物而廣泛應(yīng)用的鬼筆環(huán)肽可能對肌動蛋白大尺度結(jié)構(gòu)形態(tài)有較大的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

? ? ? ?G-actin 提取自牛骨骼肌,純化按照Spudich 和Watt 等人的方法[25 ] 。分離的肌動蛋白達(dá)電泳單點(diǎn)純,儲存于4 ℃的G-緩沖液中備用;Na2ATP、DTT 購自Sigma ,Tris-base 、Tris-HCl 購自Promega , 其余試劑均為國產(chǎn)分析純;CSPM-2000we 型原子力顯微鏡為中國科學(xué)院化學(xué)研究所本原納米儀器有限公司生產(chǎn),使用NANOPROBETM NP 型Si3N4 探針。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制　G-緩沖液( 2mmolPL Tris-Cl ,pH7. 5 , 0. 2mmolPL CaCl2 , 0. 5mmolPL DTT , 0. 2mmolPL ATP) 和F-緩沖液(5mmolPL Tris-Cl , pH7. 5 , 2mmolPLMgCl2 , 100mmolPL KCl , 1mmolPL DTT , 1mmolPLATP) 均按常規(guī)方法制備,所有使用的溶劑和新鮮配制的溶液均通過<0. 22μm 的濾膜過濾去除顆粒。

1.2.2 待測樣品制備　用F-緩沖液將1ml 純化G-actin 精確稀釋至100ml ,使溶液中G-actin的最終濃度為5μgPml ,然后將樣品置于37 ℃恒溫箱中孵育30min 使其聚合。聚合完成后,在新鮮剝離的云母表面滴加5μl 待測溶液,使其自然脫水制成待測樣品。

1.2.3 原子力顯微鏡成像　樣品制備完成后不經(jīng)過任何物理和化學(xué)處理,立即在室溫下(25℃) 用原子力顯微鏡的接觸模式成像。原子力顯微鏡采集的圖像保存為BMP 格式,儲存在電腦中做進(jìn)一步的分析。上述所有操作均在超凈工作條件下進(jìn)行,以避免污染。

2 結(jié)果

2.1 樹狀分支結(jié)構(gòu)的纖維叢

? ? ? ?肌動蛋白在體外通過自組織能夠聚合形成離散的、具有典型分形結(jié)構(gòu)特征的樹狀分支纖維叢結(jié)構(gòu),但不能形成大區(qū)域的連續(xù)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(Fig. 1) ;與微絲穩(wěn)定劑鬼筆環(huán)肽存在時(shí),形成由單根微絲和微絲束組成的、大范圍的連續(xù)交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)明顯不同[24 ] 。

? ? ? ?實(shí)驗(yàn)中,肌動蛋白通過自組織形成的樹狀分支纖維叢由多級纖維分支形成,次級纖維成份間的相互作用和微絲動力學(xué)過程的動態(tài)平衡可能是樹狀分支結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的必要條件,但詳細(xì)的聚合動力學(xué)機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

2.2 不同直徑的纖維結(jié)構(gòu)

? ? ? ?肌動蛋白可通過自組織過程聚合形成不同直徑(7nm～35nm) 的長纖維,實(shí)驗(yàn)中觀察到的最細(xì)纖維的結(jié)構(gòu)參數(shù)與單根無鬼筆環(huán)肽結(jié)合時(shí)的F-actin[19 ]一致(Fig. 2 a) ;此外,還有大量具有較大直徑和分支結(jié)構(gòu)的纖維出現(xiàn),表明有不同于單根微絲和微絲束的高級纖維結(jié)構(gòu)產(chǎn)生(Fig. 2 b～d) 。但高級纖維結(jié)構(gòu)的構(gòu)成模式還有待深入研究,初步判斷觀察到的高級結(jié)構(gòu)可能是由若干單根微絲經(jīng)過(多級) 螺旋或其它構(gòu)成方式形成的有序結(jié)構(gòu)。

肌動蛋白AFM圖像

Fig. 1 　Tree-like branch structure with fractal features.

The structure seems to be composed of multiple order helix filaments with branches , which actually indicate the possible mechanism for formation of high order actin filaments by self-organization.
肌動蛋白AFM圖像

Fig.2 Filaments with different diameters.

(a) The slimmest single filament is most similar to F-actin in size with ～7 nm width at half height and ～35 nmpitch ; (b) the filaments have much wider diameter than the slimmest F-actin ; (c) The branch filament could be con-stituted of two enlaced slimmer filaments , forming the branch in the joining point of another filament ; (d) Two fila-ments are aligned side by side , and thought that there might exist certain interaction between them , which could be theearly step for further assembly of giant filaments. The unit of scale ruler is nm.

2.3 自組織纖維結(jié)構(gòu)的3D-重建

? ? ? ?利用計(jì)算機(jī)3D成像技術(shù)對自組織纖維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了3D 構(gòu)建以獲取有用的表面結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié),結(jié)果表明不同類型的纖維結(jié)構(gòu)具有類似的表面構(gòu)象和拓?fù)湫再|(zhì),提示各種類型的纖維結(jié)構(gòu)可能來源于相同的聚合動力學(xué)過程。

2.3.1 樹狀分支結(jié)構(gòu)的3D-重建　對樹狀分支結(jié)構(gòu)的纖維叢局部區(qū)域進(jìn)行了3D-重建,發(fā)現(xiàn)其表面存在明顯的螺紋結(jié)構(gòu)(Fig. 3) ,表明粗纖維可能由更細(xì)的構(gòu)成成份纏繞螺旋而成;但分支節(jié)點(diǎn)的結(jié)構(gòu)還未能清晰地解析,其構(gòu)成方式需進(jìn)一步研究。

2.3.2 長纖維結(jié)構(gòu)的3D-重建　從長纖維結(jié)構(gòu)的3D-重建圖中,可觀察到不同直徑的纖維表面存在與樹狀分支結(jié)構(gòu)表面類似的螺紋結(jié)構(gòu)( Fig. 4) 。雖然長纖維結(jié)構(gòu)和分支結(jié)構(gòu)具有不同的表觀形態(tài),但是二者在構(gòu)成方式、聚合動力學(xué)過程以及有序結(jié)構(gòu)多態(tài)性形成的分子機(jī)制上可能存在本質(zhì)的聯(lián)系。

肌動蛋白自組織纖維結(jié)構(gòu)AFM圖像

Fig.3 3D-reconstruction of branch structure.The spiral flight can be clearly observed on the fila-ments surface , which demonstrates that the giant fila-ments could come from the thinner filament by intertwist-ing with one another in self-organization dynamics. Theunit of scale ruler is nm.

3 討論

? ? ? ?實(shí)驗(yàn)表明,作為微絲工具藥物而廣泛應(yīng)用的鬼筆環(huán)肽可能對體外肌動蛋白大尺度聚合結(jié)構(gòu)有較大的影響。在體外簡單熱力學(xué)體系中,肌動蛋白自組織為單純的、無干預(yù)的熱力學(xué)過程,完全受其內(nèi)在的熱力學(xué)特性所驅(qū)動。利用肌動蛋白聚合動力學(xué)的踏車模型可以較好地對肌動蛋白自組織行為進(jìn)行定性的分析:在F-緩沖液中,肌動蛋白的聚合過程在經(jīng)過成核期、生長期之后能夠迅速進(jìn)入動態(tài)平衡。此時(shí),結(jié)合態(tài)的纖維型肌動蛋白殘基與游離的球型肌動蛋白含量保持動態(tài)平衡。微絲的總體長度處于相對恒定的狀態(tài),受總長度的限制,單根微絲長度有限,微絲間的相互作用較難發(fā)生,形成交聯(lián)的幾率很小,因此在自組織過程中,肌動蛋白難以聚合形成連續(xù)的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)纖維結(jié)構(gòu),只能形成離散的纖維結(jié)構(gòu);在微絲穩(wěn)定劑(如鬼筆環(huán)肽) 介入時(shí),肌動蛋白聚合在經(jīng)過成核期進(jìn)入生長期之后,肌動蛋白體外自裝配由于微絲解聚合過程被抑制而受到干預(yù),正常的聚合P解聚合動態(tài)平衡受到破壞,導(dǎo)致自裝配向聚合單方向進(jìn)行,使溶液中的游離肌動蛋白和寡聚體濃度很低, 此時(shí)幾乎所有的肌動蛋白均聚合為微絲,微絲的總長度接近最大,單根微絲相對較長,彼此之間的相互作用較易發(fā)生,因而容易形成大范圍的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

肌動蛋外肌動蛋白大尺度聚AFM圖像

Fig.4 3D-reconstruction of two parallel filaments with different diameters. On the surface of the filaments , similar topological and conformational structure traits can be discerned ;suggesting that all the filaments observed in the experi-ment could result from the same thermodynamic process.The unit of scale ruler is nm.

?

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作者簡介

張軍：男，1973 年10 月17 日出生,四川南充人,博士研究生。重慶醫(yī)科大學(xué)任教,從事細(xì)胞生物學(xué)、生物物理與生物化學(xué)領(lǐng)域科研工作。已有7 篇學(xué)術(shù)論文被SCI , Medline , CA等國際檢索系統(tǒng)收錄。

Biography

ZHANG Jun : male , born in the 17th of October 1973. He is a Ph D graduate and also teaches in the Chongqing University of Medical Sciences , majoring in cell biology , biochemistry and biophysics. He has published 7 articles that have been cited by SCI , Medline and CA.